【用途】 用于山羊痘病毒核酸的检测。
【试剂】

编号	20T	50T	保存
裂解液	4mL	10mL	室温	A盒
无水乙醇	4mL	10mL	室温
去蛋白漂洗液	12mL	28mL	室温
洗涤液	32mL	77mL	室温
洗脱液	2mL	5mL	室温
蛋白酶K	0.2mL	0.5mL	-20℃	B盒
PCR反应液	200μL	500μL	-20℃
引物和探针	40μL	100μL	-20℃
阳性对照	30μL	30μL	-20℃
灭菌水	300μL	300μL	-20℃

【操作步骤】
1.样本前处理及核酸提取  
样本前处理：
取适量皮肤丘疹、肺部病变组织、淋巴结，于灭菌研钵充分研磨，用PBS按照1：3体积稀释成均匀乳剂，经10 000rpm离心3 min。
核酸提取：
(1)取200μL上述样本离心后上清液和10μL蛋白酶K加入一只新的1.5mL离心管,然后加入200μL裂解液，剧烈振荡。(蛋白酶K开盖使用后建议存于2-8℃)混匀5～10秒。
(2)56℃温浴10分钟。
(3)在上述离心管中加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀5～10秒。
(4)将步骤3中混匀的液体转移至一只套有收集管的纯化柱上，10 000rpm离心1分钟，弃去套管内液体。
(5)将500μL去蛋白漂洗液加入纯化柱上，10 000rpm离心1分钟，并弃去套管内液体。
(6)将700μL洗涤液加入纯化柱上，10 000rpm离心1分钟，并弃去套管内液体。
(7)可选：重复步骤（6）。
(8)再将纯化柱放回接液管上，13 000rpm离心1分钟。
(9)将纯化柱移到一只干净的1.5mL离心管中。
(10)向离心柱内加50μL洗脱液，室温静置1分钟后12 000rpm离心1分钟，弃纯化柱，离心管内液体中含有基因组DNA。提纯的基因组DNA如果不立即使用，请保存于-20℃。
2. 荧光PCR加样体系（总体系20 μL）：将下列试剂加入PCR反应管中。

PCR反应液 引物和探针	10μL 2μL
模   板 灭菌水	2μL 6μL

（注：阴、阳性对照设立，由试剂盒提供的阳性对照、灭菌水直接替换“模板”即可。）
 
3. 反应程序
在荧光PCR仪上进行以下反应：95 ℃ 180s，循环95 ℃ 5 s，55℃ 10 s，72℃ 20 s，共45次, 每次循环的第三步（72℃ 20 s）收集荧光信号（报告基团“HEX”，淬灭基团“BHQ1”）。
【结果判定】
1 阈值设定
检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。 
2 质控标准
(1) 阴性对照：无Ct值无扩增曲线。
(2) 阳性对照：Ct值≤30.0，并出现典型的扩增曲线。若阴、阳性对照组结果不成立，则视为无效检验。
3 结果描述及判定
阴性  被检样品无Ct值且无明显扩增曲线，判为山羊痘病毒核酸阴性；
阳性  检测样品Ct值≤42.0且出现典型的扩增曲线时，判为山羊痘病毒核酸阳性；
可疑  对于Ct值＞42.0的样品且出现典型的扩增曲线或者Ct值≤42.0但无典型的扩增曲线时，应重检，重检Ct值≤42.0且出现典型的扩增曲线时判为阳性，其他情况均判为阴性。
【注意事项】
1.B盒使用之前请完全溶解并离心数秒后使用，蛋白酶K开盖使用后建议保存于2-8℃。
2 反复冻融试剂将降低检测灵敏度，尽量减少反复冻融。
3 为避免样本间的交叉污染，模板最后加，加模板时先加阴性对照，再加检测样品，最后加阳性对照，有条件的实验室加模板的移液器应与加其它组份的移液器分开。
4 上机前注意检查确保反应混合液内无气泡，且反应管盖紧，以免荧光物质泄漏区污染仪器。
【生产企业】   
企业名称：新葡萄8883官网登录
生产地址：山东省滨州市经济开发区黄河二路169号8883net客服生物工程高科技园
电    话：0543-3403060       传    真：0543-3403060
【有效期】本制品有效期为1年，生产日期见包装内侧。
 
仅供兽医诊断使用